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微生物菌落总数

菌落总数就是指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定,即在需氧情况下,37℃培养48h,能在..

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发布时间:2021-06-25 热度:

 菌落总数就是指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定,即在需氧情况下,37℃培养48h,能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数,所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌,由于现有条件不能满足其生理需求,故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为杂菌数,需氧菌数等。

  1、菌落总数(colonies number)简介

  菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量,它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求,以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。

  菌落总数- 概念

  菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物,它是由数以万计相同的微生物集合而成。当样品被稀释到一定程度,与培养基混合,在一定培养条件下,每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数是指食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培养基成分培养温度和时间、PH值、需氧性等)所取1ml(g)检样中所含菌落的总数。

  菌落总数- 单位

  菌落形成单位叫做CFU。CFU的含义是形成菌落的菌落个数,不等于细菌个数。(比如两个相同的细菌靠得很近或贴在一起,那么经过培养这两个细菌将会形成一个菌落,此时就是2个细菌,1CFU)。菌落总数往往采用的是平板计数法,经过培养后我们数出平板上所生长出的菌落个数,从而计算出每毫升或每克待检样品中可以培养出多少个菌落,于是以CFU/ml或CFU/g报告。

  菌落总数- 作用

  菌落主要作为判定食品被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌对食品被污染程序的标志,也可以应用这一方法观察细菌在食品繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

  菌落总数- 危害

  食品的菌落总数严重超标,说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求,将会破坏食品的营养成分,加速食品的腐败变质,使食品失去食用价值。消费者食用微生物超标严重的食品,很容易患痢疾等肠道疾病,可能引起呕吐、腹泻等症状,危害人体健康安全。

  但需要强调的是,菌落总数和致病菌有本质区别,菌落总数包括致病菌和有益菌,对人体有损害的主要是其中的致病菌,这些病菌会破坏肠道里正常的菌落环境,一部分可能在肠道被杀灭,一部分会留在身体里引起腹泻、损伤肝脏等身体器官,而有益菌包括酸奶中常被提起的乳酸菌等。但菌落总数超标也意味着致病菌超标的机会增大,增加危害人体健康的几率。

  2、菌落总数的测定方法

  一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液,然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合,在一定温度下,培养一定时间后(一般为48小时),记录每个平皿中形成的菌落数量,依据稀释倍数,计算出每克(或每ml)原始样品中所含细菌菌落总数。

  基本操作一般包括:样品的稀释--倾注平皿--培养48小时--计数报告。

  国内外菌落总数测定方法基本一致,从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同,只是在某些具体要求方面稍有差别,如有的国家在样品稀释和倾注培养进,对吸管内液体的流速,稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。

  3、检验步骤

  样品的处理和稀释

  1.操作方法:以无菌操作取检样25g(或25ml),放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。

  固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min,制成1:10的均匀稀释液。

  用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混合均匀,制成1:100的稀释液。

  另取1ml灭菌吸管,按上项操作顺序,制10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。

  2.无菌操作:操作中必须有“无菌操作”的概念,所用玻璃器皿必须是完全灭菌的,不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装,应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。

  操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟,每个平板不得超过15个菌落。

  3.采样的代表性:如系固体样品,取样时不应集中一点,宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨,液体样品须经过振摇,以获得均匀稀释液。

  4.样品稀释误差:为减少样品稀释误差,在连续递次稀释时,每一稀释液应充分振摇,使其均匀,同时每一稀释度应更换一支吸管。

  在进行连续稀释时,应将吸管内液体沿管壁流入,勿使吸管尖端伸入稀释液内,以免吸管外部粘附的检液溶于其内。

  为减少稀释误差,SN标准采用取10mL稀释液,注入90mL缓冲液中。

  5.稀释液:样品稀释液主要是灭菌生理盐水,有的采用磷酸盐缓冲液(或0.1%蛋白胨水),后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品(如酱油)进行稀释,可以采用灭菌蒸馏水。

  倾注培养

  1.操作方法:根据标准要求或对污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在制10倍递增稀释的同时,以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做两个平皿。

  将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml,并转动平皿,混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。

  待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48±2h,取出计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。

  2.倾注用培养基应在46℃水浴内保温,温度过高会影响细菌生长,过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴,应以皮肤感受较热而不烫为宜。

  倾注培养基的量规定不一,从12~20ml不等,一般以15ml较为适宜,平板过厚可影响观察,太薄又易于干裂。倾注时,培基底部如有沉淀物,应将底部弃去,以免与菌落混淆而影响计数观察。

  3.为使菌落能在平板上均匀分布,检液加入平皿后,应尽快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min,以防止细菌有所死亡或繁殖。

  4.培养温度一般为37℃(水产品的培养温度,由于其生活环境水温较低,故多采用30℃)。培养时间一般为48h,有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度,琼脂平板培养48h后,培养基失重不应超过15%。

  5.为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆,不易分辨,可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板,不经培养,而于4℃环境中放置,以便计数时作对照观察。
 

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